[실험노트] 일반미생물학 실험 1. 배지만들기

실험 제목 : 배지 만들기

 

1. 실험목적

:세균 배양에 필요한 액상, 고상 배지를 만들어보고 고압증기 멸균 (autoclaving) 하는 방법을 숙지한다.

 

2. 실험 원리

: 미생물을 분리하고 보존하려면 적절한 배양 조건이 필요하다, 배지에서 세균을 키우려면 탄소원, 질소원, 무기염류 및 생리 활성 인자의 영양소가 풍부하게 들어있어야 한다,

 

배지는 물리적 상태로 액체배지, 고체배지, 반고체 배지로 나뉜다.

액체배지는 어는점 이사의 온도에서 응고가 일어나지 않고 용기를 흔들면 자유롭게 흐르는 성질을 가진 물을 기본으로 한 용액으로 정의한다.

반고체 배지는 세균의 운동성을 확인하고, 특정 장소에서의 국소적인 반응을 보기 위하여 사용한다.

일반적인 실온에서 반고체 배지는 단단한 물질로는 만들지 못하지만 굳게 할 수 있는 응고인자를 함유하고 있어서 혈전과 같은 밀도를 보인다.

고체배지는 세포들의 분리된 콜로니를 형성할 수 있는 단단한 표면을 제공하여 세균과 진균류의 분리 배양에 유리하다. 액상 배지에 아가 (agar) 라 불리는 한천을 첨가하여 고형화 시켜 만든다.

agar는 실온에서는 고체이며 물의 끓는점에서 녹는다. agar는 수분과 영양분을 저장하는 기본 골격을 형성한다. 또, 소화가 잘 안 된다는 특성이 있어 대부분의 미생물이 영양분으로 사용할 수 없다.

 

배지는 화학적 상태로 합성 배지와 천연 배지로 나뉜다.

합성 배지는 인공적으로 각종 영양소를 조합하여 만든 배지이고, 천연 배지는 동식물에서 추출한 재료를 그대로 사용하는 배지이다.

 

배지는 기능적 측면에서 enriched medium (농화 배지), 선택 배지, 분별 배지로 나뉘는데

enriched medium은 일부 층이 성장에 필수적으로 필요로 하는 혈액, 혈청 등의 복합적인 유기 물질을 함유하고 있고, 병원성 세균 등과 같이 요구조건이 까다로운 세균의 성장을 위해 고안된 배지이다.

선택 배지는 특정 미생물만 생장이 가능하도록 다른 미생물의 생장 저해제가 포함된 배지이다.

분별 배지는 주어진 배지에서 자라는 두 종류 이상의 미생물의 콜로니를 서로 구별할 수 있도록 해주는 배지를 말한다.

이번 실험에서는 LB배지를 만드는데, LB배지는 Luria Betani의 약자로 호기성 세균의 배양에 사용하는 가장 기본적인 고체배지이다. 주로 대장균 배양에 사용하지만 일반 균도 배양할 수 있다.

고압 증기 멸균은 닫힌 용기 내의 물을 가열하여 100'c 이상 포화수증기화 됨으로써 형성되는 고압 상태의 높은 멸균력을 이용하는 방법을 말한다. 멸균기의 안을 1.5 기압 하에서 온도를 121'c까지 상승시켜 15분 동안 멸균기 안의 세균을 즉시 사멸시킨다.

Yeast Extract는 효모추출물로 효모는 비타민류, 무기염류, 아미노산 류를 다량으로 함유하여 영양을 공급하는 역할을 한다.

NaCl은 삼투압의 유지를 위해 쓰인다.

Tryptone은 단백질 공급원으로 질소 공급원 역할을 한다.

Agar는 액체 상태의 배지를 고체화시키는 역할을 한다. (1.5%)

 

3. 실험재료

: Petri plate, Yeast extract, NaCl, Tryptone, Agar, 증류수, 삼각플라스크, auto clave

 

4. 실험방법

: 1) 비커에 tryptone 10g, yeat extract 5g, NaCl 10g를 혼합하여 전체 1L 비커에 증류수를 첨가한다.

2) 만든 broth를 삼각 플라스크에 붓고, 알루미늄 포일로 뚜껑을 막은 뒤 121'c에서 15 min autoclaving 한다.

3) 고체 평판 배지를 만들려면 액상 배지에 1.5% (w/v) 되도록 agar를 첨가해 함께 autoclaving 한다.

4) 47'c로 식혀서 plate 두께가 4-5mm 정도 되도록 천천히 붓는다.

 

5. 실험 결과

: tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g을 혼합하여 만든 broth를 고압증기 멸균시켜 agar를 넣은 것을 페트리 접시 3곳에 옮겨 담았다. 세균이 들어오는 것을 최대한 줄이기 위해 페트리 접시 뚜껑을 최소한으로 열었다. 실험을 시작하기에 앞서 두 손을 알코올로 소독했다.  아직 액상 상태인 배지의 열을 식히고 뚜껑에 수증기가 맺히지 않게 하기 위해 뚜껑을 살짝 열어두었다. 모든 과정은 클린 밴치에서 하는 것이 원칙이다. auto clave 돌릴 때는 멸균 테이프를 부착한다.

 

6. 고찰

:열을 식힐 때 뚜껑을 열어두는 이유는 한천 배지의 표면에 물기가 있으면 콜로니가 명확히 구분되지 않게 되어 단일 콜로니의 선별이 어렵기 때문이다. 또한 오염의 우려가 있다.

agar 첨가 양 구하기

액상 배지에 1.5% (w/v) 되도록 agar 첨가

1L 액상 배지이면 15g의 agar 첨가 => 15g/1000ml * 100 = 1.5 w/v%

 

7. 참고문헌

:일반 미생

네이버 백

https

https

https

www. d

 

사진생략

 

 

 

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