[실험노트] 일반미생물학 실험 2. 미생물의 배양 및 보존

실험 제목

: 미생물의 배양 및 보존

 

1. 실험 목적

: 혼합 배양균에서 순수한 독립 집락을 배양하기 위한 미생물 실험에서 가장 기본적인 배양 기술 습득

균수를 변이 없이 장기간 보존

 

2. 실험 원리

: 미생물의 배양에는 분리 배양과 순수 배양이 있다.

분리 배양은 여러 미생물들이 혼합된 상태에서 특정한 미생물만을 분리하는 방법을 말한다.

균의 특성에 따라 고체 평판배지를 이용한 분리배양과 액세 배지를 이용한 분리 배양법이 있다.

순수 배양은 종균의 보존, 상태 및 생리 관찰에 이요하며 사면 배양법과 천자 배양법이 있다.

분리 배양에는 획선 평판법, 주입 평판법, 도말 평판법이 있다.

획선 평판법은 분리 배양 하고자 하는 미생물의 시료를 백금에 뭍혀 고체 평판 배지의 한 쪽에서부터 S자형으로 가볍게 그어 배지 전면에 획선을 긋는 방법이다.

주입 평판법은 미생물의 시료를 연속적으로 희석시킨 후에 시료의 일부를 굳기 전의 고체 배지에 혼합하여 평판접시에 함께 부어 굳힌 배지를 이용하는 방법이다.

도말 평판법은 single colony를 분리하기 위해 사용되는 방법이다. 잡종균의 세균수를 줄여 배지에 분산되도록 하는데 가장 많이 이용되는 방법이다. 접종균 수가 적어 배지 표면에 colony 사이가 충분히 떨어져 배양되기 때문에 colony를 얻기 위한 가장 기본적인 방법이다.

순수 배양에는 사면 배야잉 있는데 호기성 균의 배양에 이용된다.

미생물 보존의 원리는 세포 내에 함유된 수분을 조절하는 동시에 이 수분들이 관여해 일어나는 생체 대사를 조절하기 위해 환경을 조절하는 것이다. 생존율을 높이고, 형질 유지, 경제성, 간편성, 안전성에 유의해야 한다. 대사 바능ㅇ을 저하시키는 방법에는 저온유지, 산소제한, 영양분 제한이 있다. 수분의 이동을 정지시케는 방법으로 냉동 보존법이 있다. 수분을 제지시키는 방법으로 건조 보존법, 동결 건조 보존법, 담체 보존법이 있다. 이 중에서 우리 실험에는 동결보존 (냉동보존)을 실험한다.

동결보존은 온도가 낮을수록 좋고 장기 보전의 경우 -70'c 이하의 온도가 요망된다. -80'c 전후의 냉동고가 사용되며 액체 질소 탱크 (gas : -170'c, liquid: -190'c)가 가장 좋다. 급송 동결이 좋으며 보조제로 글리세린 (10-20%), DMSO(5-10%)를 첨가한 증식용 배양액에 균체를 부유한 후 서서히 동결한다. 수분 증발을 막기 위해 파라필름 (parafilm)으로 싸서 보존한다.

동결보존에서 보조제를 넣는 이유는 세포 내의 얼음 결정 생성을 방지하여 세포 손상을 감소시키기 위함이다.

 

3. 실험 재료

: E.coli (Escherichia coli), 40% glycerol, LB agar, 알코올 램프, 백금이, 파이펫, frozen vial

 

4. 실험 방법

1) 도말 평판

백금이를 알코올 램프에 비스듬이 세워 백금 부분 전부가 발갛게 달구어 질 때까지 완전 가열하여 화염 멸균한다.

화염 멸균한 백금이를 오염되지 않도록 주의하면서 냉각시킨 후 1 colony만을 취한다. -> 평판에서 inoculum(배양액)을 취함

멸균된 평판 배지의 뚜껑을 비스듬이 열고 수차례 왕복하여 중복되지 않은 선을 그어 접종한다. -> 1차 streaking

다시 백금이를 화염, 멸균하여 냉각시킨 후 1차 streaking과 교차되도록 두번째 선을 긋는데 1차 streaking과 두 번 정도 중복된 선을 그어서 조금만 묻힌 후 선을 긋는다 -> 2차 streaking

또 다시 백금이를 화염 멸균시켜 냉각시킨 후 2차 streaking과 같은 바업ㅂ으로 세번쨰 선을 긋는다 -> 3차 streaking

사용한 백금이는 화염 멸균 시키고 접종한 페트리 디쉬는 뒤집어 배양한다.

 

2) 동결 보존

균주액을 파이펫으로 0.5ml 취하여 frozen vial에 넣는다.

40% glycerol 역시 사용하지 않은 파이펫으로 0.5ml 을 균주액 넣은 vial에 함께 넣어주고 잘 섞어준다.

-70'c 초저온 냉동고 (deep freezer)에 냉동보관한다.

 

5. 실험 결과

백금이를 알코올 램프에 소독하고 E.coli 배양액을 취하여 배지에 선을 긋는다. 이렇게 3차 streaking까지 완료하였다. 실험 결과, 1차, 2차 도말한 것에는 세균이 많이 번식하였고 3차 도말에는 세균이 점 모양으로 배양된 것을 관찰할 수 있었다. 즉 단일 colony를 관찰할 수 있었다. 1차 -> 3차로 갈수록 배양된 세균의 수가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다.

동결보존 실험에서는 낙하균 방지를 위해 알콜램프를 켜고 글리세롤 0.5ml, E.coli 0.5ml를 vial에 넣고 피펫팅 해주었다.

(사진생략)

 

6. 고찰

실험 결과에서 1차 streaking한 곳은 균이 가장 많이 번식하였고 2차는 1차보다 조금, 3차는 균이 거의 배양되지 않은 것을 볼 수 있었다. 1차 도말에서 배양액을 너무 많이 묻혀서 양 조절에 실패하여 2차 도말에서 많은 균이 번식하게 되었다. 초기 E.coli 양을 적절히 조절하는 것이 중요하다는 것을 알았다. 패트리 접시를 뒤집에서 배양하는 이유는 외부 환경으로부터의 오염과 습기를 막기 위해서이다. 또 E.coli를 중력과 같은 방향으로 배양함으로써 더 잘 배양되도록 하기 위해서이다. 이론만 봐서는 백금이를 소독하고 3차까지 streaking하는 과정을 이해하지 못했는데 실험 결과를 보니 이해가 되었다. 실험에서 3차 도말까지 진행하는 것은 독립된 순수 배양 colony를 얻기 위함인데 실험 결과를 보면 3차 도말에서 독립된 세 개의 colony를 관찰할 수 있다. 하지만 확대해서 보니 세균이 공모양으로 크게 뭉쳐있는 모습처럼 보이기도 한다. 처음에 E.coli균을 채취할 때 양조절이 중요한 이유를 다시한번 깨달았다.

백금이로 streaking 할 때 백금이를 충분히 식혀야 하는데 그렇지 않으면 배지가 녹아 틈이 생겨 미생물의 독립된 순수배양 colony를 얻기 힘들다.

동결보전 실험에서 글리세롤은 동결 보조제의 역할을 한다. 글리세롤의 점성으로 인해 미생물 주변을 감싸면서 급속냉각으로 인해 생성되는 배양액의 결정으로부터 미생물이 파괴되는 것을 막아준다.

추가조사) pour plate method 미생물의 시료를 연속적으로 희석시킨 후에 시료의 일부를 굳기 전의 고체 배지에 혼합하여 평판 접시에 함께 부어 굳힌다. 용액 내의 세균수를 측정하거나 세균을 순수분리 하는데 쓰이며 주로 수질 검사에 이용. spread plate method 배지 중앙에 소량의 액상 시료를 넣고 멸균 유리막대로 고루 펼친다. 페트리 접시는 배양하기 전 1~2시간 건조시킨다. 획선평판법이나 도말평판법으로 얻는 콜로니들은 표면 콜로니로서 콜로니 형태(모양, 색상)를 볼 때 용이하다. 순수분리를 위해서 특정 콜로니를 분리배양 할 수 있다. steak plate method 분리 배양하고자 하는 미생물의 시료를 백금이에 뭍혀 고체 평판배지의 한쪽에서부터 S자 형으로 가볍게 그어 배지 전면에 획선을 긋는 방법이다. 획선 시작부위는 미생물의 수가 많지만 획선 마지막 부분에서는 미생물의 수가 1ml당 1~2개가 되도록 한다. 일반적으로 균을 분리하는데 가장 널리 쓰이는 방법이다.

 

7. 참고 문헌

https

biozo

naver

일반미생물

blog.n

biome

 

 

 

 

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