[실험노트] 일반미생물학 실험 6. 현미경을 이용한 미생물의 관찰

1. 실험 제목 : 세균의 염색과 형태 관찰과 그람염색 Gram staining

 

2. 실험 일시 :

 

3. 실험 목적 :

Gram 염색법에 의해 세균의 감별 염색 (differential stain) 방법을 익히고 세균의 Gram 염색에 따른 분류와 Gram 염색의 원리를 익힌다.

 

4. 실험 원리 :

Gram 염색은 세균학에서 가장 많이 사용되는 세균의 동정 또는 구분에 쓰이는 방법으로 Gram positive (+)균과 Gram negative (-) 균을 구별하는 염색이기 때문에 differential stain 이라고도 한다. 1884년 덴마크의 Hans Cristian Gram에 의해 처ㅇ므으로 개발된 방법으로 각종 검체 및 현미경적 검사에 이용되며 미생물에 의한 감영 여부를 조기에 진단할 수 있게 해준다. 그람 염색 결과 보라색으로 염색되는 세균은 그람양성이며, 붉은색으로 염색되는 세균은 그람음성이다. 그람 염색의 주된 원리는 그람 양성균과 그람 음성균의 세포벽 구조의 차이에 의해 그 원리를 설명할 수 있으며 다음과 같은 두 설이 제기된다.

 

(1) 세포벽(Cell wall)의 차이

 Gram 양성균은 세포벽 자체가 두터운 peptidoglycan (murein: 50~80%, mucopeptide)의 층(20~80nm)으로 싸여있고, 세포막과 peptidoglycan 층으로부터 바깥쪽으로 teichoicacid가 연결되어 있다. Gram 음성균은 그 구조가 복잡하고 inner layer인 2~5nm만이 엷은 peptide-glycan으로 되어있고, 그 외부를 싸는 out layer는 20~30nm가 단백질과 lipo-polysaccharide(LPS)의 모자이크 층으로 구성되어있다.

Cell wall

-Outside of plasma, membrane

-Protection from osmotic lysis

-Shape and strings from peptidoglycan

-Gram-positive cell wall

20~82nm 두께의 homogeneous peptidoglycan or murein layer

구성 -> plasma membrane, peptidoglycan, teichoic acid (polymer of glycerol or ribitol)

=> violet

*대표적인 그람양성균 : Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio

 

Gram negative cell wall

:2~7nm peptidoglycan layer, 7~8nm outer membrane

periplasmic space (periclasm) -> 많은 enzyme, cell wall 합성요소

구성 -> plasma membranem periplasmic spacem peptidoglycan, outer membrane

outer membrane은 LPS, porin protein(작은 물질 통과)을 지니고 있음

*LPS (lipopolysaccharide)

-Buride in OM(outer membrane), endotoxin 라고 불림.

-LipidA, core polysaccharide, O side chain 으로 이루어져 있음

-기능 : 막구조의 안정화

-OMP는 G(-) bacteria를 항생제 bile salt 등으로부터 보호한다. => red

*대표적인 그람음성균 : Candida, E.coli O157, Esherichia coli, salmonella, Acetobacter

 

(2) 그람 염색 원리

 가설 1) 그람 염색에 있어서 crystal violet과 iodine의 염색으로 세포 내에 이들의 불용성 complex가 생성되고, alcohol로 탈수하면 그람양성의 경우에는 두터운 peptideglycan층의 구멍에 막혀서 탈색이 되지 않는데 비해, 그람 음성은 외막과 엷은 peptideglycan 층을 통해서 쉽게 탈색되기 때문에 그람 염색성이 다르게 나타남.

 가설 2) 그람 양성균의 균체 표면에는 SH기를 함유하는 단백질과 결합한 magnesium ribonucleate 라는 산성물질이 있어 염기성 염료인 crystal violet과 결합하여 alcohol에 탈색되지 않고 자색으로 염색되고, 그람 음성균의 세포벽에는 magnesium ribonucleate가 없어 탈색제인 alcohol에 의해 탈색된 후 safranin에 의해 적색으로 염색됨.

 

5. 실험 재료 :

Crystal violet 시약, Gram iodine 용액 (lugal 시약), 탈색제 (50% Ethyl alcohol 용액), Safranin 용액 (대표염색액)

6. 실험 방법 :

1) 깨끗한 slide glass 위에 균체를 넓게 펴서 도말, 건조, 고정 시킨다.

2) Crystal violet을 도말 표본 위에 가하여 1분간 염색한다. -> primary stain

to import color to all cells -> to stain all cell purple

3) slide glass 를 뒤집어서 약하게 흐르는 수돗물로 수세하고 Gram's iodine solution으로 30초~1분간 매염한다. -> mordant

-Forming an insoluble complex by binding to primary stain -> Crystal violet - Iodine (CV-I) complex to intensify the color of the stain : purple black in gram positive cells; Mg-RNA-CV-I 형성

4) 수세 후 탈색제로 10~20초간 탈색시킨다. 이 때 시간을 너무 오래 두면 그람 양성균이 탈색되어 그람 음성균으로 보이므로 주의한다. -> decolorizing agent

-To establish a color contrast, based on the chemical composition of cellular comporents

-Lipid solvent 와 protein dehydrating agent 로써의 기능 : depending on lipid conc of microbial cell walls

-Gram-positive (low lipid conc) : lipid solvent (dissolving lipid)

-> cell wall pores 형성 -> Alcohol's dehydrating effect -> closing pores -> Retention of Mg - RNA - CV - I (Blue)

-Gram-negative (High lipid conc) : lipid solvent (dissolving lipid)

-> cell wall pores 형성 -> Alcohol's dehydrating effect -> Closing pores -> Removal of the CV - I complex (colorless or unstained)

5) 수세 후 safranin O solution으로 30초간 대여로 염색한다 -> safranin

-A contrasting color to that of the primary stain

-To stain red cells that have been previously decolorized)

:Only gram- negative cells

6) 현미경으로 관찰한다.

 

7. 참고문헌 :

https://www.westlab.com.au/blog/10-tips-for-observing-bacteria-under-bacteria-microscope

10 Tips for Observing Bacteria Under Bacteria Microscope

https://compost.css.cornell.edu/preparing.html

Preparing Slides of Microorganisms

 

https://microbeonline.com/general-and-differential-characteristics-of-gram-positive-and-gram-negative-bacteria/

Gram-Positive vs. Gram-Negative Bacteria • Microbe Online

 

8. 실험 결과 :

락토 바실러스 균을 1루프 취해 슬라이드 위에서 증류수와 섞고 말렸다.

crystal violet으로 염색, 요오드 용액처리, 알코올로 탈색, safranin으로 염색을 하고 현미경으로 관찰했다.

관찰 결과 자주색으로 염색된 균을 볼 수 있었다. 균의 형태는 명확하게 관찰되지 않았다.

자주색인것을 보아 그람 양성균임을 알 수 있었다. 실험에서 사용한 균은 락토코커스이므로 원래 나선균 모양으로 관찰되어야 한다.

 

9. 고찰 :

염색 과정에서 알코올 탈색 과정을 거쳤는데, 너무 오래 탈색 할 경우 색이 사라지고, 너무 짧게 하면 gram 음성균도 자주색으로 남는데, 실험 결과 사진을 보면 자주색이 과도한 것으로 보아 염색 시간이 짧았을 것이라고 추측된다.

또한 나선균의 형태로 관찰되지 않은 것으로 보아 슬라이드 준비 과정, 혹은 염색 과정에 문제가 있었을 수 있다고 생각된다. 슬라이드에 너무 많은 균이 있거나 염색 과정이 불균일했을 가능성이 있다.

따라서 현미경을 이용한 미생물 관찰 실험에서 주의해야 할 점을 알아보았다.

샘플 준비 시 슬라이드에 균을 취할 때 너무 많은 균을 취하지 않도록 해야한다. 적절한 양이 균이 있을 때 슬라이드 위에서 염색이 골고루 되기 때문이다.

또한 슬라이드에서 샘플을 충분히 건조시켜야 염색 단계에서 균이 탈락되거나 염색이 균일하지 않게 되는 것을 방지할 수 있다.

혹은 결과 관찰 시 적절한 배율을 선택하지 않았기 때문에 나선균이 관찰되지 않았을 가능성도 있다. 관찰균의 크기에 맞는 적절한 배율을 선택하는 것이 중요하다.

그람 양성균과 그람 음성균은 구조적으로 차이가 있다. 그람 양성균은 90%의 펩티도글리칸과 기타 단백질, 다당류, teichoic acid 층으로 구성되어 있고 그람 음성균은 10%의 펩티도글리칸, 인지질, 지단백 (lipoprotein), 지질다당류 (lipopolysaccharide)로 구성되어 있다.

그람 음성균은 외막이 존재한다. 외막은 지질다당층이 있으며 중심다당류와 O-다당류가 존재하는데 O-다당류는 면역반응을 일으키며 O항원 구조로 영향을 끼쳐 변화시킨다. 외막 밖의 대부분으로 인지질을 대체하며 톡성을 가진 내독소로 인체 내에 들어갈 시에 면역세포를 활성화 시킨다.

그람 음성균에 있는 포린 단백질은 세포막을 관통하는 단백질로 분자들이 이동하는 통로이다. 다른 운반단백질과 달리 포린은 수동확산이 일어날 수 있다. 수동확산이란 분자 농도가 높은 곳에서 낮은 곳으로 이동하는 것이다. 포린은 보통 당, 이온, 아미노산과 같이 작은 분자들의 이동에 관여한다. 포린의 선택적 투과성으로 특정 분자만 통과시킨다.

그람 염색 원리 가설 첫번째, 세포 내에 불용성 염색체인 CV-I가 형성되어 그람 양성균, 음성균 모두 보라색으로 보이는 것을 알콜로 씻어내면 그람 양성균은 펩티도글리칸 층이 두껍게 감싸고 있어 펩티도 글리칸 층 안에 형성된 굵은 입자인 CV-I는 세포벽을 빠져나오지 못하고, 반면 앏은 펩티도 글리킨 층을 가진 그람 음성균의 CV-I 복합체는 쉽게 빠져나와 탈색이 잘 된다.

두 번째 가설은 그람 양성균에는 magnesium ribonucleate가 CV와 결합하여 탈색되지 않고 그람 음성균에는 magnesium ribonucleate 가 없어 알콜에 의해 탈색된다는 것이다.

magnesium ribonucleate는 산성물질로 염기성 염료인 crystal violet과 결합하는데 이 요오드 용액은 매염제로 사용되어 magnesium ribonucleate와 CV의 결합을 촉진시킨다.

 

 

 

제 블로그를 찾아주셔서 감사합니다!

도움이 되셨다면 공감이나 댓글 부탁드립니다.✒️