[실험노트] 일반미생물학 실험 8. 미생물의 번식 측정 O.D 측정

1. 실험 제목 : 미생물의 번식 측정 - O.D 측정

 

2. 실험 일시 :

 

3. 실험 목적 :

세균에 배양시간에 따른 균수 (균체량) 변화를 조사하기 위하여 분광광도계를 이용하여 균수(균체량)을 측정하는 방법을 익힌다. 그것으로부터 세균의 생육곡선을 작성하여본다.

 

4. 실험 원리 :

세균과 효모와 같은 단세포 미생물의 균체량과 균수는 일정한 비례를 가지므로 분광광도계를 이용하여 탁도를 측정함으로써 균수를 직접적으로 측정할 수 있다.

 

분광광도계에서 탁도는 흡광도 단위로 표시하고 흡광도의 측정은 균수의 측정으로 연결할 수 있다. 이 방법은 같은 시료를 연속적으로 간편하고 신속하게 측정하는 것이 가능하고 미생물의 성장속도를 측정하는데 널리 사용되고 있다. 하지만 이 측정법은 생균과 사균을 구별할 수 없다는 것이 가장 큰 단점이다.

 

-spectrophotometer에서 620nm 사용 (가시광선 영역)

 

-흡광도 (Optical Density : O.D) 

주어진 파장에서 빛을 흡수할 수 있는 분자수가 많을수록 주어진 파장의 빛을 더욱 효과적으로 흡수할 수 있는 분자일수록 빛의 흡광도가 커진다. => Beer-Lambert 법칙에 의함

 

-Growth

미생물의 세포 구성 성분이 증가하여 세포 크기가 커지거나 세포 분열에 의해 수가 증가하는 것으로 일반적으로 미생물의 수적 증가를 의미한다.

 

-Growth wave (in a closed system or batch culture)

1) Lag phase (지체기, 유도기)

새로운 배지에 접종 시 또는 오래된 세균 접종 시 성장이 즉시 일어나지 않음

새로운 효소나 DNA 등의 세포 구성 성분을 합성하는 환경 적응 단계

새로운 영양성분의 이용에 필요한 효소 합성, ATP 등의 합성기간

 

2)Exponential phase (log phase, 대수기)

미생물의 성장이 최대로 일어나는 시기

배지와 미생물의 종류에 따라 다름

generation time : 1회 세포분열에 필요한 시간

E.coli 20min, 결핵균 12hr

doubling time (두배 되는데 걸리는 시간)

N(t) = N(o) + 2t

 

3) Stationary phase (정지기)

미생물의 성장이 중지되어 성장 곡선이 수평을 이룸

성장속도 = 사멸속도 or 성장중지 (냉장 저장시)

요인 : 109 cell/ml 이상의 미생물수, 영양분의 고갈, toxic waste accumulation 호기성 균의 경우 O2의 공급 감소

starvation이 일어나면 미생물은 endospore을 만들거나 모양이 변함

G(+)는 G(-) 로 보일 수 있음

protoplast shrinkage, nucleoid condensation

-Starvation protein 합성

(DNA - binding protein chaperon - 단백질 변성 방지)

-cell wall strength 증가 - 결과적으로 외부 자극에 더 강한 세포가 되어 병원성인 경우 병원성이 강해짐

-inclusion body 증가 (metachromatic granule - phosphate, poly-beta-hydroxy-butyric acid (PHD) - glucose 과잉)

4) Death phase (사멸기)

영양성분 고갈, toxic waste 의 축적으로 살아있는 세포수가 감소

미생물의 성장곡선의 필요

product 얻을 때 - log phase 극대화, lag phase 최소화

cell mass 필요시 : early S phase에서 균체 회수

미생물의 배양시간 (x축)에 따라 얻어진 흡광도의 log 값 (y축)을 그래프로 표현

 

5. 실험 재료 :

멸균배지 (LB)

세균 배양액 (E.coli S cerecisiae)

spectrophotometer, micro pipet, 100ml 삼각 플라스크)

 

6. 실험 방법 :

-접종하기

1) 100ml 삼각 플라스크에 담긴 LB에 0.5ml 접종한다.

2) 바로 흔들어주고 첫 번째 O.D 측정한다

3) 30'c incubator에 넣고 온도를 확인하면서 배양한다.

 

-O.D 측정

1) 먼저 blank 를 찍기 위해 접종하지 않은 배지 1ml 을 취하여 (무균으로 진행) 셀에 넣고 620nm로 측정 => 배지를 4'c 냉장고에 보관한다. (오염되었을지라고 균이 자라지 못하게 하기 위함)

2) 무균으로 sample 1ml 를 취하여 셀에 넣고 O.D 측정하여 균주를 배양한 플라스크는 바로 incubator에 넣는다.

 

7. 실험 결과 :

흡광도 측정 결과

 

generation time 구하기

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8. 고찰

세균수의 로그값을 배양시간에 따라 그래프로 그려 얻은 생장곡선은 Log phase, Exponential phase, stationary phase, Death phase 네 시기를 갖는다. Lag phase(유도기)에는 세포 수의 증가가 없고 세포의 부피(질량)이 증가한다. 새로운 환경에 적응하는 시기(분열준비기)로 RNA, 효소, 기타물질의 합성이 활발하게 이루어진다. 미생물의 종류, 배지의 특성, 보관방법 등이 유도기 길이에 영향을 준다. exponential phase (대수증식기)에는 활발한 세포 증식이 이루어진다. 세포 집단의 수가 2배로 되는데 걸리는 시간을 generation time 이라고 하며 짧을수록 증식 속도가 빠르다. stationary phase(정체기)는 외관상으론 세균수의 증가가 없으나 실제로는 세포증식속도=사멸속도 인 상태이다. 그 원인은 영양소 고갈, 생육 저해물질의 축적, 공간적 제한이다. 대수기의 세포보다 크기는 작으나 저항성이 강하고 이 시기에 내생포자가 형성된다. 세포 외 효소의 분비와 2차 대사산물의 합성이 일어난다. death phase(사멸기) 에는 세포 수가 감소한다. 주 원인에는 세포 내부 에너지 고갈, 세포 구조의 파괴, 효소의 불활성화가 있다.

O.D는 optical density의 약자로 세포를 시험관에 배양한 다음 빛(파장 600nm)을 투과하여 나온 혼탁도의 계수를 이용하여 그 대략적인 값을 알 수 있다. O.D를 측정하는 것은 미생물 세포가 빛을 산란시키는 것을 이용하는 방법으로 분광광도계를 이용하여 세균의 농도에 정비례하게 빛이 산란된 정도를 측정한다.

 

generation time

N(0) = 초기 세포수, N(t)= 시간 t에서의 세포수, n = t 시간 통안의 세대수라고 하면

N(t) = N(0) x 2^n이라고 할 수 있다.

 

람베르트-비어 법칙

흡광도 측정법으로 쓰이는 빛의 흡수에 관계하는 lambert 법칙과 beer 법칙을 조합한 법칙이다.

두께 d에서 농도 c의 물질의 층에 입사하는 입사광의 강도 I(0) 이 층을 투과한 투과광의 세기를 I로 하였을 때

흡광도 E는 log I(0)/I , E=k*c*d

Lambert 법칙은 흡광도가 흡수층 두께에 비례, Beer 법칙은 흡수하는 물질의 농도에 비례.

 

9. 참고 문헌

https://en.wikipedia.org/wiki/Absorbance

Absorbance - Wikipedia

https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Microbiology/Microbiology_(Bruslind)/09%3A_Microbial_Growth

9: Microbial Growth