[실험노트] 분자생물학 실험 3. Gel electrophoresis 겔 전기영동 실험보고서

1. 실험 제목 : Gel electrophoresis 겔 전기영동

 

2. 실험 날짜 :

 

3. 실험 방법 :

1) Gel 만들기

- LE agarose와 0.5 TAE buffer 1 : 100 비율로 혼합 후 완전히 녹임

- 틀, tray comb를 이용하여 loading 가능한 상태로 굳혀줌

2) 전기영동

- 0.5 TAE buffer 기기에 채워준 후 굳힌 gel 기기에 넣어줌 (홈이 (-) 부분으로 위치하도록)

- ladder loading

- Sample loading : dye + star 3ul + sample 4ul loading (스카치 테이프 위에서 pipeting)

135v, 15~20min

 

4. 실험 재료 :

PCR products, eppen tube, eppen tube rack, pipet, tip, latex gloves, DNA ladder for gel electrophoresis, loading star, 6x loading buffer, TAE buffer, LE agarose, Gel electrophoresis machine, Gel doc

 

5. 실습

 

Gel Electrophoresis Procedure

1) 0.5x TAE buffer 만들기

=> 50x TAE buffer 1 : 3'dw 99 비율로 만듦

*gel 만들 때, 전기 영동기에 채우는 용으로 사용

 

2) Gel 만들기 (1% 아가로스겔)

LE agarose 1  : 0.5x TAE buffer 100의 비율로 혼합 (1% agarose gel)

(-TAE buffer 100ml 에 LE agarose 1g)

가루가 소량일 시 0.5x TAE buffer 를 잘 풀어줘 다 넣을 수 있도록 한다.

뚜껑을 살짝 덮어서 전자레인지에 돌려 녹여준다.

 

3) Gel 틀 조립

 

4) Gel을 틀에 넣어 굳히기

전자레인지에서 젤 만든 것을 꺼내 틀에 넣는다.

틀과 Tray를 놔두고 젤을 부어준다.

pipet tip 으로 젤을 꾹 눌러주어 기포를 없애고 평평하게 만들어준다. 30분 후 gel 이 굳어 있는 것을 확인한다.

(*바로 사용할 것 아니면 0.5 TAE buffer에 넣어두기)

 

전기영동 준비

1) loading sample 준비

불투명한 스카치 테이프를 넉넉하게 끊어 실험대에 붙인다.

loading star 로딩스타 (DNA의 double strand 사이에 끼어들어가 uv 쬐었을 때 보이게 해주는 역할)

loading star 1ul 씩 분주 (갯수 = 전기영동 내릴 sample 수 + ladder 수) -> 간격 넉넉

6x loading dye (loading 했을 때 색깔을 볼 수 있게 해줌)

6x loading dye 를 ladder를 제외한 전기영동 내릴 샘플의 수 만큼의 loading star 1ul 위에 분주 (DNA ladder 에는 이미 6x loading dye가 들어있음)

 

2) ladder loading

DNA ladder (1Kb+) 를 loading star 1ul 만 분주해놓은 것 위에 분주하여 파이펫팅 후 파이펫으로 그대로 흡입하여 젤의 홈에 걸어준다.

0.5x TAE buffer 안으로 들어가 젤에 흘려보낸다는 느낌으로 해준다.

 

3) Sample loading

loading star 1ul 와 6x loading dye 1ul 이 분주되어 있는 것 위에 전기영동 할 샘플 4ul 를 분주하여 pipeting, 그대로 흡입하여 젤의 홈에 걸어줌

 

4) 전기영동기 작동

(135v, 20min) 3가지 색 중 마지막 dye가 끝까지 내려왔으면 다 된 것. gel 을 꺼내서 buffer를 잘 털어준다. gel doc 기기의 uv 조사를 통하여 band 확인.

 

+ DNA ladder (1Kb+) 만들기

1Kb plus DNA ladder (size 아는 것을 섞어놓은 mixture) 180ul eppen tube에 분주

6x loading dye 180ul eppen tube에 분주

3'dw 720ul eppen tube에 분주 pipetting 하여 잘 섞어줌

100ul 씩 eppen tube에 분주하여 사용

 

6. 결과

Q) 0.5x TAE buffer 1000ml 를 만드는데 필요한 50x TAE buffer?

=> 50x TAE buffer -> 0.5x TAE buffer (100배 희석)

50x TAE buffer : dw = 1 : 99

따라서 10ml 의 50x TAE buffer 가 필요함.

 

겔 전기영동 결과

 

겔 전기영동 결과

7. 고찰

전기영동 실험은 지난주에 cell lysis한 gDNA로 진행하였다. 전기영동의 결과를 보면 밴드가 위쪽으로 형성된 것으로 보아 gDNA의 사이즈는 크다고 할 수 있다. 밴드가 깨끗하게 형성되지 않아 정확한 DNA의 양은 알 수 없었으나 DNA ladder 와 비교해보면 10000-12000bp 범위에서 두꺼운 stand 가 관찰되는 것을 볼 수 있다.

DNA ladder 와 sample 모두 깨끗한 밴드가 형성된 것을 관찰 할 수 없지만 흐릿하거나 얼룩진 밴드가 형성되었음을 볼 수 있다.

만약 겔이 완전히 굳지 않았다면, band 가 사진에서 보는 것과 같이 왕관 모양으로 형성되며, 샘플의 양 또는 농도에 따라 흐릿하거다 얼룩진 모양으로 관찰된다. 번진 band의 모양은 샘플 퀄리티가 좋지 않음을 나타낸다. 만약 샘플이 단백질에 오염되거나, 염이 많이 포함되거나, 변질된 경우에도 band가 번질 수 있다.

 

8. 참고문헌

 

 

 

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